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桦褐孔菌原生质体制备与再生

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龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 桦褐孔菌原生质体制备与再生 作者:李珺 郭成金 来源:《天津农业科学》2011 年第 06 期 摘 要:采用正交设计方法对桦褐孔菌原生质体最佳制备与再生条件从酶条件、酶解时 间、温度等 5 个方面进行了研究。试验结果表明:其原生质体制备最佳条件是以液体静置培养 6 d 的菌丝体,0.6 mol·L-1 KCl 作为渗透压稳定剂,在 30 g·L-1 溶壁酶作用下,32 ℃酶解 4 h,制备率达 2.675×107 个·mL-1;再生最佳条件是液体静置培养 10 d 的菌丝体,0.6 mol·L-1 NaCl 为渗透压稳定剂,在 30 g·L-1 溶壁酶作用下,32 ℃酶解 2 h,再生率为 6.83%。 关键词: 桦褐孔菌;原生质体;制备率;再生率;正交设计法 中图分类号:S646.9 文献标识码:A DOI 编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2011.06.003 Protoplast Preparation and Regeneration of Inonotus obliquus LI Jun, GUO Cheng-jin (College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387,China) Abstract: The influence of enzyme system, enzymolysis time, temperature, mycelial age and osmotic pressure stabilizer on the preparation and regeneration of Inonotus obliquus protoplasts were studied by orthogonal design.Orthogonal analysis showed that the highest protoplast product (2.675×107 ·mL-1) was obtained from 6-day-old mycelium, digested by 30 g·L-1 lywallzyme for 4 hours at 32 ℃, using 0.6 mol·L-1 as osmotic pressure stabilizer. Protoplasts produced in the condition that 10-day-old mycelium, at 32 ℃ by 0.6 mol·L-1NaCl,30 g·L-1 Lywallzyme digesting 2 hours were optimal to regeneration. The regeneration rate was 6.83%. Key words: Inonotus obliquus; protoplast;preparating rate; regenerating rate; orthogonal design 桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.) Pilat]隶属于真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、多孔 菌科、卧孔菌属。它富含 β-D-葡聚糖,其含量是红樟菌的 30 倍;SOD 含量是红樟菌的 23 倍,是灵芝的 55 倍。长期的动物实验及临床实验表明:桦褐孔菌无毒副作用,主要作用有抗 癌、预防艾滋病、治疗糖尿病、抗衰老、增强免疫力等[1]。笔者较系统研究了桦褐孔菌原生 质体的制备和再生条件,为今后对桦褐孔菌原生质技术工作提供有益支持。 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 1973 年,Devriers 等[2]对裂褶菌原生质体发育研究成功,将原生质体融合技术运用到蕈菌 研究领域。原生质体技术已作为研究蕈菌生理、生化、遗传等基础理论和改良菌种的一种重要 方法和有效手段。采用原生质体技术进行真菌良种选育的研究已有许多成功报道,但就桦褐孔 菌原生质体育种研究而言,至今鲜见报道。笔者利用正交设计方法对桦褐孔菌原生质体制备与 再生的条件进行探讨。 1 材料和方法 1.1 材 料 桦褐孔菌[Inonotus obliquus (Fr.) Pilat]由天津师范大学蕈菌研究所提供。 试剂:葡萄糖,酵母粉,牛肉膏,MgSO4·7H2O,KH2PO4 ,KCl,NaCl,VB1 ,蔗糖, 甘露醇;琼脂,溶壁酶,蜗牛酶,纤维素酶 R-10。以上均为分析纯和生化试剂。 试验仪器:YXQG02 手提式压力蒸汽消毒器,SW-CJ-2 超净工作台,TGL-16G 高速冷冻 离心机,HH-S 恒温水浴锅,Galen 显微镜等。 固体斜面培养基:棉籽皮 200 g·L-1 和马铃薯 200 g·L-1(浸提液)、葡萄糖 20 g·L-1、 KH2PO4 3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、VB10.04 g·L-1、琼脂 20 g·L-1,pH 值自然。 液体培养基:葡萄糖 20 g·L-1、蔗糖 20 g·L-1、酵母粉 0.5 g·L-1、牛肉膏 1 g·L-1、 KH2PO4 3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1,VB10.01 g·L-1,pH 值自然。 再生培养基:液体培养基+琼脂 6 g·L-1,以 0.6 mol·L-1 蔗糖配制,pH 值 6.5。 再生对照培养基:液体培养基+琼脂 6 g·L-1,以蒸馏水配制,pH 值 6.5。 0.6 mol·L-1 甘露醇、蔗糖、NaCl、KCl。 1.2 方 法 取生长旺盛的菌丝尖端接种于盛 50 mL 液体培养基的 100 mL 三角瓶中,25 ℃静置暗培养 8~17 d。 按表 1 称取各种酶,用相应的渗透压稳定剂溶解制成酶液,经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌 备用。 挑取表 1 中相应菌龄的菌丝体置



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